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DNase I是一种内切核酸酶，可作用于与嘧啶相邻的磷酸二酯键以产生具有末端5′-磷酸的聚核苷酸。当Mg2+存在时，DNAse I可独立切割DNA的每条链且切割位点是随机的。当Mn2+存在时，两条DNA链都几乎是在同样的位置被切割。最适pH在7-8之间。二价阳离子如Mn2+, Ca2+, Co2+以及Zn2+都是酶的激活剂。5 mM浓度的Ca2+可稳定酶免收蛋白水解酶的消化。
来自牛胰腺的DNAse I由四种色谱可区分的组分A，B，C和D组成，它们的摩尔比分别为4:1:1。仅有少量的D被发现。2-巯基乙醇、螯合剂、十二烷基硫酸钠（SDS）和肌动蛋白都已知可抑制酶的活性。
